Устойчивые к метициллину штаммы S. aureus были у ежей еще до открытия антибиотиков

 

Рис. 1. Европейский ёж (Erinaceus europaeus) и гриб Trichophyton. Грибы этого рода живут на коже ежей и других млекопитающих (включая человека), питаются кератином и вызывают различные микозы, такие как стригущий лишай. Фото с сайтов flickr.com и en.wikipedia.org

Быстрое распространение штаммов золотистого стафилококка, устойчивых к метициллину и другим бета-лактамным антибиотикам (метициллинрезистентный Staphilococcus aureus, MRSA) традиционно связывают с широким использованием этих антибиотиков в медицине и животноводстве. Новое исследование показало, что некоторые разновидности MRSA возникли задолго до открытия антибиотиков и чаще встречаются у диких европейских ежей, чем у людей и домашних животных. На примере одной хорошо изученной страны (Дании) удалось показать, что люди чаще заражаются теми вариантами MRSA, которые преобладают у местных ежей. Другие дикие и домашние животные тоже могут переносить MRSA, но ежи, по-видимому, являются главным природным резервуаром определенных разновидностей этих микробов. Устойчивость к метициллину и другим бета-лактамам могла развиться у S. aureus в ходе адаптации к жизни на коже ежей, зараженных паразитическим грибом — дерматофитом Trichophyton erinacei. Этот гриб производит сразу два бета-лактамных антибиотика: пенициллин G и 6-(5-гидрокси-n-валерамидо)-пенициллановую кислоту. Ежиные штаммы MRSA надежно защищены от обоих антибиотиков двумя генами, mecC и blaZ. Эти гены расположены рядом друг с другом внутри встроенного в геном мобильного элемента, который неоднократно передавался от одних бактерий к другим. Белки, кодируемые этими генами, используют две принципиально разные стратегии защиты от бета-лактамных антибиотиков.

Метициллинрезистентный золотистый стафилококк (Methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA) впервые был обнаружен в 1960 году, почти сразу после того, как врачи начали использовать метициллин для борьбы со штаммами стафилококка, устойчивыми к пенициллину. Сегодня MRSA поражает более 170 000 человек в год в одной только Европе и считается серьезной угрозой здоровью человечества (см.: World Health Organization, 2017. Global priority list of antibiotic-resistance Bacteria to guide research, discovery, and development of new antibiotics). MRSA всё чаще обнаруживают у домашних животных (свиней, коров, коз, овец, лошадей, кур), которые сами обычно не очень страдают от инфекции, но могут передавать ее людям.

Распространение MRSA традиционно связывают с широким применением антибиотиков из группы бета-лактамов в медицине и животноводстве. При этом известно, что MRSA встречается также у диких млекопитающих и птиц. До сих пор предполагалось, что дикие животные обычно заражаются MRSA от людей и домашних животных (а не наоборот).

Еще в 1960-е годы было замечено, что у европейских ежей часто встречаются штаммы золотистого стафилококка, устойчивые к пенициллину. Тогда же было показано, что гриб Trichophyton erinacei, дерматофит, живущий на ежиной коже, производит антибиотик, похожий на пенициллин. Таким образом, стало ясно, что S. aureus мог приобрести устойчивость к пенициллину задолго до открытия Александра Флеминга, адаптируясь к ежам и их кожным грибам (J. M. B. Smith, M. J. Marples, 1965. Dermatophyte lesions in the hedgehog as a reservoir of penicillin-resistant staphylococci).

Пенициллинрезистентные, но чувствительные к метициллину стафилококки защищаются от пенициллина при помощи фермента пенициллиназы. Эта защита не срабатывает против метициллина и других бета-лактамных анитибиотиков, устойчивых к пенициллиназе. Метициллинрезистентные штаммы S. aureus (MRSA) используют другую защиту: у них есть ферменты PBP (penicillin-binding protein) 2a и 2b, которые кодируются генами mecA и mecC. Ферменты PBP необходимы для синтеза бактериальной клеточной стенки: они соединяют друг с другом соседние нити полимера пептидогликана, составляющего основу клеточной стенки. Бета-лактамы блокируют работу обычных PBP (на этом и основано их антибактериальное действие), но бессильны против версий PBP2a и PBP2b, которые обладают пониженным сродством к бета-лактамам. Поэтому гены mecA и mecC надежно защищают стафилококков почти от всех бета-лактамных антибиотиков, включая устойчивые к пенициллиназе.

Недавно выяснилось, что у ежей в Швеции и Дании подозрительно часто встречаются метициллинрезистентные штаммы S. aureus с геном mecC (mecC-MRSA, см.: S. L. Rasmussen et al., 2019. European hedgehogs (Erinaceus europaeus) as a natural reservoir of methicillin-resistant Staphylococcus aureus carrying mecC in Denmark). Это позволило предположить, что дикие ежи являются естественным резервуаром не только пенициллинрезистентных, но и метициллинрезистентных стафилококков mecC-MRSA, и что происхождение этих штаммов тоже связано с адаптацией к антибиотикам, производимым грибом Trichophyton erinacei. Вскоре были получены первые косвенные подтверждения этой гипотезы, основанные, правда, лишь на данных по 23 шведским ежикам (F. Dube et al., 2021. Benzylpenicillin-producing Trichophyton erinacei and methicillin resistant Staphylococcus aureus carrying the mecC gene on European hedgehogs — A pilot-study).

Более основательно подошел к делу международный коллектив из 64 исследователей, опубликовавший в журнале Nature результаты изучения 276 ежей из 10 стран (девяти европейских и Новой Зеландии, куда европейских ежей завезли между 1869 и 1892 годами). Обследовались ежи из центров реабилитации для диких животных.

У 101 животного на коже и слизистой носа обнаружились метициллинрезистентные стафилококки mecC-MRSA. Зараженные особи происходят из Соединенного Королевства, Чехии, Дании, Португалии и Новой Зеландии. В остальных странах (Греция, Румыния, Италия, Франция, Испания) у всех ежей тесты оказались отрицательными (рис. 2).

Рис. 2. Встречаемость стафилококков mecC-MRSA у ежей из разных стран. Шесть родственных групп (клональных комплексов) mecC-MRSA показаны разными цветами, белый цвет соответствует пробам, в которых стафилококки mecC-MRSA не были обнаружены. Размер круга соответствует количеству проб. С каждого ежа брали по три пробы (с кожи, носа и ступней), самый большой круг (UK-4) соответствует 40 ежам и 120 пробам. Рисунок из обсуждаемой статьи в Nature

Полногеномное секвенирование показало, что ежиные стафилококки mecC-MRSA подразделяются на шесть линий («клональных комплексов») с различающейся эволюционной историей. Ген mecC у всех линий находится во встроенном в геном мобильном элементе, который называется SCCmec (type XI staphylococcal cassette chromosome mec). Вплотную к гену mecC в том же мобильном элементе сидит еще один ген устойчивости к бета-лактамным антибиотикам — blaZ, кодирующий пенициллиназу. Другие варианты мобильного элемента SCCmec, несущие ген mecA (а не mecC), встречаются у других метициллинрезистентных штаммов S. aureus (mecA-MRSA), которые вызывают наиболее серьезные медицинские проблемы (H. F. Chambers, F. R. DeLeo, 2009. Waves of resistance: Staphylococcus aureus in the antibiotic era). Происхождение их неясно, к ежам они отношения не имеют и в обсуждаемой статье не рассматриваются.

Кроме того, у исследованных ежей было обнаружено 22 штамма S. aureus, чувствительных к метициллину (MSSA), некоторые из которых относятся к тем же клональным комплексам, что и mecC-MRSA (это говорит о довольно частых горизонтальных переносах генов устойчивости от одних стафилококков к другим). У ежиных MSSA нет гена mecC, однако у 14 штаммов из 22 есть другая, сильно отличающаяся версия гена blaZ. Ген mecA, имеющийся у других (не ежиных) MRSA, приходится примерно таким же дальним родственником mecC, как эти две версии blaZ друг другу.

Авторы также изучили геном дерматофита Trichophyton erinacei на предмет наличия в нем генов синтеза антибиотиков — и обнаружили гены, ответственные за производство пенициллина G (бензилпенициллина). При помощи жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии удалось показать, что, помимо пенициллина G, T. erinacei производит еще один бета-лактамный антибиотик — 6-(5-гидрокси-n-валерамидо)-пенициллановую кислоту. Какие гены отвечают за ее синтез, пока неизвестно, поэтому их и не нашли в геноме гриба.

Эксперименты с природными и генетически модифицированными стафилококками показали, что выделения гриба T. erinacei резко подавляют рост штаммов S. aureus, лишенных защитных генов, чуть меньше вредят штаммам с геном mecC, еще меньше — штаммам с геном blaZ, а наилучшую защиту дает комбинация обоих генов. При этом та версия blaZ, которая характерна для ежиных S. aureus, гораздо лучше защищает от выделений гриба, чем альтернативная версия этого гена, встречающаяся у других (не ежиных) пенициллинрезистентных штаммов золотистого стафилококка.

Таким образом, результаты согласуются с идеей о том, что адаптация золотистых стафилококков к жизни на ежах, зараженных грибом T. erinacei, могла способствовать распространению защитных генов mecC и blaZ.

Для большей доказательности, конечно, следовало бы посмотреть, как соотносится зараженность грибом T. erinacei с встречаемостью MRSA у ежей. Но авторы не смогли этого сделать, как они пишут, по этическим соображениям. Ведь для идентификации дерматофитов нужно брать не просто мазки с поверхности кожи или слизистой, а кусочки кожи, волосы и иглы, а ёжиков из реабилитационных центров нельзя так обижать.

Попытки авторов детально реконструировать на основе геномных данных эволюционную историю ежиных штаммов mecC-MRSA (для этого использовались, помимо ежиных, сотни близких штаммов, выделенных из людей и жвачных) не дали однозначных результатов. Картина получается слишком сложная и запутанная, но кое-какие выводы что всё же удалось сделать. За последние два-три столетия разные штаммы стафилококков многократно переходили с одних хозяев на других (долгая жизнь в жвачных или людях оставляет в геномах узнаваемые следы адаптации к конкретному хозяину), пересекали водные преграды (например, путешествовали из Дании в Англию и обратно) и обменивались генами устойчивости к антибиотикам посредством горизонтального переноса. Некоторые обнаруженные у ежей разновидности mecC-MRSA приобрели свою устойчивость лишь в XX веке — возможно, уже после того, как люди начали применять бета-лактамные антибиотики в медицине и животноводстве. Однако для части ежиных штаммов удалось показать, что они были метициллинрезистентными задолго до этого момента. Полученные данные в целом согласуются с гипотезой о том, что распространение в популяциях золотистого стафилококка мобильного элемента SCCmec с генами устойчивости mecC и blaZ изначально было связано с адаптацией стафилококков к ежам и их дерматофитам. Напомним, что происхождение более важных в медицинском плане метициллинрезистентных штаммов S. aureus с другими вариантами SCCmec, несущими ген mecA (а не mecC), с ежами не связано и в статье не рассматривается.

В настоящее время метициллинрезистентные золотистые стафилококки mecC-MRSA встречаются у диких европейских ежей гораздо чаще, чем у людей и домашних животных, — по крайней мере в тех европейских странах, по которым есть такие данные. Например, в Дании зараженность ежей mecC-MRSA составляет 61%, тогда как у коров, овец и коз она варьирует от 0% до 1,1%, а у людей выявляют лишь от 3 до 36 заражений в год.

Рис. 3. Географическое соответствие между разновидностями метициллинрезистентных стафилококков mecC-MRSA у диких ежей (слева) и людей (справа) в Дании. Рисунок из обсуждаемой статьи в Nature

По-видимому, дикие ежи до сих пор являются важным природным резервуаром mecC-MRSA, из которого опасные патогены периодически передаются людям и другим животным. Это хорошо видно при сопоставлении данных по разновидностям mecC-MRSA, выявленным у ежей и людей в разных районах Дании (рис. 3). Наблюдаемое соответствие, скорее всего, указывает на систематический занос инфекции от ежей к людям (в результате непосредственного контакта или при посредничестве домашних животных), а не в обратную сторону. Ведь у ежей этой заразы гораздо больше, чем у людей. К тому же ежи намного меньше путешествуют, что придает ежиным инфекциям четкую географическую структуру.

Исследование показало, что дикие животные могут играть более важную роль в распространении устойчивости к антибиотикам, чем принято считать.

Источник: J. Larsen et al. Emergence of methicillin resistance predates the clinical use of antibiotics // Nature. 2022. DOI: 10.1038/s41586-021-04265-w.

Александр Марков

https://bit.ly/3golowC

Выявлен антибактериальный компонент, эффективный в отношении резистентных форм Staphylococcus aureus

Резюме. Соединение, извлеченное из морских глубоководных губок, проявляет выраженную антибактериальную активность в отношении устойчивых к метициллину стафилококков

Согласно данным недавнего исследования, алкалоид, экстрагированный из глубоководной морской губки, проявляет высокую антибактериальную активность в отношении резистентных к метициллину форм Staphylococcus aureus. Будучи устойчивыми к большинству бета-лактамных антибиотиков, среди которых в том числе метициллин, пенициллин, оксациллин и амоксициллин, эти бактерии часто могут служить причиной летальных исходов. Так, по данным Центров по контролю и профилактике заболеваемости (Centers for Disease Control and Prevention), США, ежегодно фиксируется более чем 80 тыс. случаев инвазивных инфекций, обусловленных резистентными формами Staphylococcus aureus, а также 11 285 связанных с ними смертей. Результаты работы, проведенной исследователями Харборского отделения Института океанографии Флоридского атлантического университета (Harbor Branch Oceanographic Institute, Florida Atlantic University), США, опубликованы в издании «Marine Drugs» 11 января 2017 г.

Исследователям удалось не только выделить, но и изучить структуру и биологическую активность нового индольного алкалоида — основы многих биологически активных компонентов. Новое вещество, проявляющее антибактериальную активность, названо драгмацидин G (dragmacidin G). В ходе исследования выявлено, что указанный индольный алкалоид обладает широким спектром биологической активности, включая ингибирование резистентных форм Staphylococcus aureus, а также панкреатических линий раковых клеток.

Руководитель исследования Эми Райт (Amy Wright), доктор философии и профессор Флоридского атлантического университета, которая курирует Институтскую программу исследования препаратов, отметила, что губки вида Spongosorites являются источником ряда биологически активных бисиндольных алкалоидов, которые проявляют достаточно широкий спектр активности в отношении бактерий, вирусов, грибов, плазмодиев, а также цитотоксическое и противовоспалительное влияние. Авторы работы подчеркнули, что при экспериментальном изучении нового биологически активного вещества продемонстрирована его высокая эффективность, которая в 10 раз превышала действие описанных ранее бисиндольных соединений, сохраняя при этом селективность в отношении бактериальных клеток.

За прошедшее десятилетие командой исследователей собрана база материалов, активность которых изучалась на предмет эффективности в отношении различных заболеваний как в лабораториях Харборского отделения Института океанографии Флоридского атлантического университета, так и в других партнерских лабораториях. В каждом случае после предварительного изучения активности определенного биоматериала следующим этапом исследования является проведение направленного фракционирования биологических проб для очистки биоактивных натуральных продуктов. Структура этих новых соединений изучается методом спектроскопии с акцентом на применении ядерно-магнитно резонансной спектроскопии. Применяя эти методы, исследователи могут изучать механизм действия новых соединений, используя широкий спектр методов, включая такие, как низкомолекулярная иммунохимическая хроматография для наблю­дения, подобно настоящему исследованию, развития бактериальных колоний, резистентных к драгмацидину G, с последующим исследованием генетических модификаций у резистентных бактерий. Кроме того, Э. Райт и соавторы сотрудничали с исследователями Университета центральной Флориды (University of Central Florida), анализируя особенности ингибирования роста Mycobacterium tuberculosis и Plasmodium falciparum. В серии трех последовательных анализов выявлена высокая эффективность фракций, содержащих новый очищенный бисиндольный алкалоид. В настоящее время ученые планируют дальнейшие исследования на основе полученных предварительных результатов.

• Florida Atlantic University (2017) Compound from deep-water marine sponge could provide antibacterial solutions for MRSA. ScienceDaily, Feb. 8 (https://www.sciencedaily.com/releases/2017/02/170208094147.htm).
• Wright A.E., Killday K.B., Chakrabarti D. et al. (2017) Dragmacidin G, a bioactive bis-indole alkaloid from a deep-water sponge of the genus spongosorites. Mar. Drugs, Jan. 11 (http://www.mdpi.com/1660-3397/15/1/16).

Наталья Савельева-Кулик

Рибопереключатели — новая мишень для антибиотиков

Рис. 1. Принцип поиска соединений, блокирующих синтез рибофлавина в бактериях. а — в присутствии ингибитора рибофлавин восстанавливает рост бактерий. b — и флавинмононуклеотид (FMN), и рибоцил блокируют функцию мРНК гена, участвующего в синтезе рибофлавина. Они связываются с рибопереключателем — регуляторным доменом в некодирующей области мРНК и блокируют ее трансляцию в белок. с — структуры флавинмононуклеотида и рибоцила сильно различаются. Рисунок из синопсисак обсуждаемой статье в Nature

Скрининг почти 57 000 токсичных для бактерий синтетических соединений позволил выявить высокоспецифический регулятор трансляции мРНК одного из генов пути синтеза рибофлавина, жизненно важного для батерий. Несмотря на отличие структуры этого регулятора (его назвали рибоцилом) от структуры естественного регулятора флавинмононуклеотида, рибоцил тоже оказался способным блокировать этот путь, выключая рибопереключатель гена ribB и подавляя таким образом трансляцию мРНК. Рибопереключатели могут стать перспективными мишенями для разработки новых синтетических лекарственных средств.

Открытие и успешное применение антибиотиков для лечения инфекционных заболеваний можно считать величайшим достижением медицины ХХ века. Открыватели антибиотиков были удостоены Нобелевских премий: в 1939 году премию присудили Герхарду Домагку за открытие антибактериального эффекта пронтозила (см. Prontosil), а в 1945 году премия досталась Александру Флемингу, впервые выделившему пенициллин, иХоварду Флори с Эрнстом Чейном, получившим его в чистом виде. Термин «антибиотики» был предложен в 1942 году Зельманом Ваксманом, который был награжден Нобелевской премией за открытие стрептомицина(в 1952 году). Традиционно антибиотиками называли природные антибактериальные или антигрибковые агенты. В последнее время это название распространяют и на искусственно синтезированные соединения, которые в ряде случаев даже более активны, чем природные.

Открытие антибиотиков оказалось одним из главных прорывов в медицине ХХ века и позволило справиться с большим числом ранее неизлечимых болезней. Но некоторое время назад стало ясно, что массовое применение антибиотиков служит сильным драйвером естественного отбора для многих патогенных бактерий, в результате чего они рано или поздно могут вырабатывать механизмы резистентности (устойчивости) к антибиотикам(см. также статьи А. Чубенко «Антибиотиковый апокалипсис» и Д. Гилярова «Конец прекрасной эпохи»). Можно выделить следующие основные пути приобретения резистентности:

• приобретение бактерией ферментов, разрушающих или модифицирующих антибиотик (например, в результате приобретения генов таких ферментов от других бактерий при помощи горизонтального переноса генов);
• перестройка структуры рибосом, в результате которой они перестают связываться с антибиотиком, блокирующим трансляцию;
• мутации мишеней антибиотиков — белков, участвующих в биогенезе клеточной стенки бактерий;
• генетические мутации бактерий, меняющие их метаболизм так, что пути метаболизма, блокируемые антибиотиком, перестают быть необходимыми;
• перестройки клеточной стенки бактерии или механизмов транспорта через нее, в результате которых антибиотик либо не проникает в клетку, либо быстро выводится.

Из сказанного ясно, что медицинская практика постоянно требует новые антибиотики. Однако многие фармацевтические компании отказываются от таких разработок, считая их нерентабельными.

Рис. 2. Структурная формула рибофлавина. Рисунок с сайта en.wikipedia.org

Исследователи корпорации Merck не последовали этой тенденции. Они сосредоточились на поиске соединений, подавляющих рост бактерий за счет блокировки у них пути синтеза рибофлавина (витамина В₂). Рибофлавин (рис. 2) является предшественникомфлавинмононуклеотида (ФМН) и флавинадениндинуклеотида — коферментов (небелковых компонентов) ряда окислительно-восстановительных ферментов, жизненно важных для всех организмов. Многие бактерии, растения и грибы могут синтезировать рибофлавин. Если рибофлавина в среде достаточно, срабатывает регуляторный механизм по принципу отрицательной обратной связи, и его синтез прекращается. (Позвоночные, в том числе человек, синтезировать рибофлавин не могут, а получают его с пищей. Человеку рибофлавин и его производные необходимы для продукции антител, образования эритроцитов и осуществления функции гемоглобина, многих других функций органов и организма.)

Поиски блокаторов путей синтеза рибофлавина проводились на модельном объекте — кишечной палочке. Эти пути одинаковы для многих микроорганизмов, в том числе болезнетворных. Нужные вещества искали среди синтетических низкомолекулярных ингибиторов роста бактерий: ученых интересовали те из них, которые подавляют рост бактерий за счет блокировки у бактерий синтеза рибофлавина. То есть эти ингибиторы должны были подавлять рост бактерий в отсутствие в среде рибофлавина, но позволять рост при наличии рибофлавина (рис. 1). На кишечной палочке было проверено примерно 57 000 (!) соединений и найдено то, которое отвечало нужным требованиям. Это вещество назвали рибоцилом (ribocil). При испытании in vivo на мышах рибоцил примерно в 1000 раз тормозил размножение патогенных бактерий.

В поисках мишени действия рибоцила ученые выращивали бактерии в присутствии сублетальных концентраций этого соединения, чтобы вывести устойчивые клоны. Когда бактерии переставали погибать от рибоцила (что означало, что они приспособились и выработали мутации устойчивости к рибоцилу), геномы полученного клона полностью секвенировали и сравнивали с геномом исходной кишечной палочки. Таким образом ученые определяли, в каких местах произошли мутации.

Оказалось, что мутации, вызывающие устойчивость к рибоцилу, локализованы в так называемомрибопереключателе гена ribB (рис. 3), кодирующего фермент DHBP-синтазу (см. DHBP synthase), ответственный за синтез одного из предшественников рибофлавина. Рибопереключатель представляет собой нуклеотидную последовательность, расположенную в 5′-нетранслируемой области мРНК перед последовательностью, кодирующей белок; он характеризуется выраженной вторичной структурой и служит для регуляции трансляции (о рибопереключателях, или РНК-переключателях, см. Сложные РНК-переключатели — новый механизм регуляции генов, «Элементы», 18.10.2006). Когда ФМН находится в среде в достаточном количестве, он образует с рибопереключателем конформацию, препятствующую трансляции мРНК. При дефиците ФМН трансляция мРНК возобновляется. Несмотря на то что структура молекулы рибоцила сильно отличается от ФМН, рибоцил тоже образует комплекс с рибопереключателем гена ribB и блокирует трансляцию мРНК. Это было подтверждено данными рентгеноструктурного анализа.

Рис. 3. Структура рибопереключателя гена ribB и локализация мутаций устойчивости к рибоцилу. а — cхема функционирования рибопереключателя гена ribB. Слева — флавинмононуклеотид (ФМН) связывается с аптамером рибопереключателя и вызывает изменение конформации платформы экспрессии, блокирующее трансляцию. Справа — в отсутствие ФМН конформация аптамера позволяет трансляцию. b — рассчитанная вторичная структура рибопереключателя гена ribB. Зелеными квадратами отмечены точки контакта с ФМН. Розовым цветом обозначены мутации устойчивости к рибоцилу. Рисунок из обсуждаемой статьи в Nature

Таким образом, авторы впервые идентифицировали синтетическую молекулу, способную «выключать» рибопереключатель несмотря на то, что она сильно отличается от природного эффектора. Это отличие снижает возможность проявления каких-то нежелательных побочных биологических эффектов. И действительно, даже очень высокие концентрации рибоцила оказались нетоксичными для мышей. В общем, авторы показали, что некодирующие рибопереключатели могут стать перспективными мишенями для разработки новых синтетических лекарственных средств. Если предложенный подход найдет практическое применение, то можно надеяться, что болезнетворные микроорганизмы достаточно долго не смогут выработать резистентность к новым антибиотикам.

Источники:
1) John A. Howe et al. Selective small-molecule inhibition of an RNA structural element // Nature. 2015. V. 526. P. 672–677.
2) Thomas Hermann. Non-coding RNA: Antibiotic tricks a switch // Nature. 2015. V. 526. P. 650–651. (Синопсис к обсуждаемой статье.)

Вячеслав Калинин